HRP标记抗体方法

2019.03.24-2   文章来源:抗体世界

方案一

标记比例:(抗体 :HRP标记质量比位 1:1;抗原 :HRP质量比为 1:4 左右); 根据标记比例计算所需 HRP量 X。

一、蛋白透析

1、 目标蛋白透析到 CB(pH9.6,50mM) 中,换液 2 次以上。

二、酶的氧化

2、 称取 Xmg HRP干粉 (Biozyme or Sigma)溶于 X/20 mL ddH2O 中。

3、 称取 NaIO4 y mg( y>X),溶于y/20 mL的ddH2O中,吸取 X/20 mLNaIO4 溶液与X/20 mL的HRP溶液缓慢混合, 4℃下静置 30min 。(此时溶液为绿色)注意:此后的操作均在避光条件下进行。

4、 吸取 X μL乙二醇(体积太小,难以控制,所以请应事先用水稀释至50μL进行)缓慢加入氧化后的 HRP溶液,室温避光静置 30min。(此时溶液为褐色)。

三、标记

5、 将氧化好的HRP直接加入到已透析充分的抗原/抗体蛋白

6、 继续透析到 CB(pH9.6,50mM) 中,换液 2 次以上;

7、 加入 X/5mg NaBH4到其中(需新鲜配置,先溶于10X μL的ddH2O 中),4℃静置 2hr(不能再透析),每 30min 摇动 1 次。

8、 PBS(10mM,pH7.2)透析过夜, 标记液中加入体积比 50%的甘油,混匀后置于 -20℃保存。

方案二

HRP标记抗体的方法 ( 戊二醛二步法和简易过碘酸钠法 )

一、戊二醛二步法戊二醛为一种双功 能试剂,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合,形成酶- 戊二醛 - 免疫球蛋白结合物。

二、简易过碘酸钠法

本法是以 NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再与Ig上的氨基相结合,所获酶标记抗体的产率高,将近70%的HRP和Ig结合,99%的Ig与酶结合,酶与Ig的活性无重大损失,是目前最常用的方法。

1. 原理

戊二醛为一种双功能试剂,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合,形成酶 戊二醛 - 免疫球蛋白结合物。

2. 标记步骤

(1)称取 HRP25mg溶于 1.25%戊二醛溶液中,于室温静置过夜。

(2)反应后的酶溶液经Sephadex G-25 层析柱,用生理盐水洗脱。流速控制在 1ml/1 分钟, 收集棕色流出液。如体积大于5ml,则以PEG浓缩至5ml。放置 25ml小烧杯中,缓慢搅拌。

(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml,搅拌下逐滴加入酶溶液中。

(4)用 1M PH9.5 碳酸缓冲液 0.25ml ,继续搅拌3小时。

(5)加 0.2M 赖氨酸 0.25ml ,混匀后,置室温 2 小时。

(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置 4℃ 1 小时。

(7)3000rpm 离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次, 最后沉淀物溶于少量 0.15M PH7.4 的 PBS中。


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