实验动物免疫注意事项(经验总结)-武汉戴安

2019.03.11-1   文章来源:武汉戴安生物技术有限公司

免疫动物的选择

●一般来说抗原来源与动物种属的亲缘性越远,免疫效果越好。最常用的免疫动物是兔子,大小鼠,豚鼠等,可以根据需要获得的抗血清的量来选择实验动物,一般来说一只兔子可以产生40-50ml兔血清,一只老鼠可以产生300-500ul小鼠血清。

●关于实验动物性别选择,雌性温顺气味小,雄性健壮体型产血多但大气味大并且容易互相打架撕咬导致死亡,可尽量选择雌性。

免疫原选择和制备

●免疫原可谓是多种多样,可以是蛋白质,可以是多肽等其他小分子化合物,可以是灭活的病毒等等,需要根据抗原的免疫原性,亲水性,是否为跨膜蛋白质等综合评估分析选择;

●抗原处理上,半抗原小分子需要偶联蛋白BSA,KLH,OVA等才可以免疫;

●抗原需要和佐剂混合均匀,佐剂可提升抗原的免疫原性,增强免疫效果。

佐剂选择制备和周期

●初免用完全佐剂,之后的加强免疫用不完全佐剂(佐剂市面上有很多种,可自行选择,sigma佐剂不错)。

●佐剂的混匀有特别的方法,混匀程度的好坏也是免疫原制备很关键的一步,很多公司都有一套自己的方法,目前最好的混匀方法应该就是用试管混匀仪器,具体的可以详细咨询武汉戴安生物技术有限公司。

●佐剂的使用应该按照每千克动物0.5-1mg,不使用佐剂的话抗原用量需提高10-20倍。佐剂是否等比混匀需要根据佐剂种类来确定,一般弗氏佐剂是一比一的或者佐剂可以多些,但是佐剂不能比抗原少,否则会形成相反的水包油的状态。水性佐剂对比例要求没那么严格可根据抗原属性和动物耐受性选择。

●周期并非严格固定,根据免疫应答的情况制定。

●建议周期:第1天 主注射,第28天 第一次加强注射,第42天 第二次加强注射,第49天 第三次加强注射,第56天 试取血+ELISA检测(约10ml血清),第57天 第四次加强注射,第65天 一般ELISA效价达到预期标准,再加强免疫一次即可终放血。一般终放血在最后一针免疫一周后进行。

免疫剂量

●免疫抗原用量不宜过高,过高可能导致动物产生免疫耐受。不同的抗原免疫原性不一样,这取决于其分子量、化学活性基团、立体结构、物理性状和弥散速度。大分子免疫原性好可以适当降低免疫剂量,相反小分子可以适当提高免疫剂量。

●普通大分子抗原建议:兔子:主注射400ug抗原/只实验兔,加强注射 125ug抗原/只实验兔;小鼠:主注射100ug抗原/只实验小鼠,加强注射 50ug抗原/只实验小鼠;大鼠:主注射100ug抗原/只实验大鼠,加强注射 50ug抗原/只实验大鼠。

免疫效价

●要想达到较高的效价,首先抗原要特异性高,纯度好,其次要注意免疫的手法和免疫的时间;

●一般来说两次免疫只能保证动物有IgG抗体,但不一定能得到高效价的抗体,一般要免疫3到5次,效价才能提高。效价受抗原性质,佐剂,免疫手法等多方面影响,一般说来效价>1:10000, 即认为有抗体产生,效价>1:100000,即认为得到了较多有效抗体。效价越高,免疫效果越好,抗体越好。

免疫途径

●免疫途径一般有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等,最常用的是皮下多点注射。

●对于不易获取的珍贵抗原可采用淋巴结免疫法,腹腔注射(腹腔注射吸收快,不适宜早期免疫用)等。

免疫后血清保存

●抗血清性质很稳定,需要保存在-20度,保存时间可达10年之久。

是否需要阴性血清

●实验动物免疫主要用于制备单克隆抗体或者多克隆抗体。在动物免疫前需要保留部分免疫前血清,之后开展免疫,最后进行抗体效价检测。

●免疫前血清在后期主要用作对照品,比如说用ELISA检测效价时需要对照血清,同时免疫前血清还可以评价该实验动物之前是否进行过相关的抗原免疫。

增强免疫效果,缩短免疫时间

●免疫效果在抗原合格的情况下,可考虑利用不同的免疫佐剂尝试和延长免疫周期获得。

●缩短免疫时间,动物耐受程度是有一定限度的,太大过量的抗原容易使动物致死,在免疫周期上没有固定的时间,建议按正常周期免疫,可提前取血检测效价有没有打起来。

免疫其他情况

●用多肽免疫动物时,偶联后多肽有时会存在一些析出或者不溶的现象,在溶解时遇到不溶是非常普遍的现象,稍微用PBS处理后,一般不会或极少影响免疫效果。

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